Western及IP细胞裂解液使用操作指南

Western及IP细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100， 低浓度sodium pyrophosphate等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

操作说明：（仅供参考）

对于培养细胞样品：

1. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

2. 对于贴壁细胞：去除营养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗）。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。 对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必须分装成50-100万细胞/管，然后在裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

3. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

4. 裂解液使用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100μL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150μL或200μL。每100万细胞用100μL本产品裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为2-4mg/ml，不同细胞有所不同。

对于组织样品：

1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

3. 按照每20mg组织加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。）

4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex是样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续试验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

注意事项：

1.为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融?？梢允实狈肿昂笫褂?。

2.裂解样品的所有步骤都需要在冰上或4℃进行。

3.本产品仅供科研实验用，不做其它用途。

4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。